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      首頁    檢測技術    實時熒光定量PCR技術

       

      技術簡介

       

              實時熒光定量PCR技術(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR)是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied biosystems公司推出,在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,使每一個循環變得“可見”,最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(或cDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。

      技術原理

       

      在Real-time qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續的分析擴增相關的熒光信號,隨著反應時間的進行,監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期,產生熒光的水平不能與背景明顯地區別,而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期,因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量,并由此來推斷模板最初的含量。

       

      技術優勢

       

      1. 通過引物或探針與模板的特異性雜交來鑒別模板,具有很高的準確性,假陽性低,特異性好。

      2. 光譜技術和計算機技術的聯合使用,極大提高了檢測靈敏度,甚至可以檢測到單拷貝的基因。

      3. 不受擴增效率和試劑損耗的影響,可以利用指數期的Ct值定量起始模板量,精確性高。

      4. 可以將擴增和檢測同步完成,不需開蓋,不僅交叉污染和環境污染機會少,且自動化程度高。

      5. 沒有后處理,不用雜交、電泳、拍照,實時縮短了反應時間。

       

      應用范圍

       

      1. DNA或RNA的絕對定量分析,包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物拷貝數的檢測,RNAi基因失活率的檢測。

      2. 基因表達差異分析,例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等),特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA或差顯結果的確證。

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